Mesure de l’activité du complément: quoi, pourquoi, comment?

Posté par Timothée le 18 Apr 2007 dans , , , , , 5 commentaires

Depuis quelques semaines maintenant, je travaille sur l’immunocompétence d’un poisson, Leuciscus cephalus (L. 1758), et plus précisément sur les liens entre l’immunocompétence et l’infection par des parasites. Parmi les protocoles utilisés, il y en a un qui me préoccupe assez particulièrement depuis quelques jours, principalement d’ailleurs parce qu’il ne fonctionne pas.

Introduction

Pour replacer ce protocole dans son contexte général, je vais faire quelques remarques sur le travail auquel je participe. Le constat de base est que tout individu possède, à chaque instant donné, une quantité limitée d’énergie à allouer entre différentes fonctions. Comme l’ont fait remarquer Moller et Erritzoe (2002), « les parasites, par définition, réduisent le fitness de leur hôte en exploitant des ressources qui en d’autres circonstances auraient été utilisées pour la maintenance, la survie, ou la reproduction ».

En d’autres termes, en présence de parasites, un hôte va augmenter l’énergie allouée au système immunitaire, au détriment des autres (Sheldon et Verhulst 1996). La question est : est-ce mesurable ? Si oui, comment ? Et quelles sont les relations entre les différents facteurs ?

Leuciscus cephalus (dont le nom français doit être Chevaine) est un poisson. Les poissons sont des organismes poïkilothermes, c’est-à-dire que leur température corporelle est régulée principalement par des facteurs abiotiques (dans le cas des poissons, la température de l’eau). Dès que l’on s’intéresse à l’immunité, cette information devient d’une importance capitale.

Chez les organismes poïkilothermes, la réponse immunitaire adaptative est plus longue à mettre en place, et énergétiquement plus coûteuse. De fait, dans la défense contre les parasites, les mécanismes de l’immunité innée sont plus fréquemment utilisés (Buchmann 1999; Buchmann et Lindenstrøm 2002; Jones 2001; Watts et al. 2001).

Approche

Nous avons donc concentré notre étude sur différents aspects de la réponse innée chez le poisson. Parmi les facteurs étudiés figure l’activation du complément. On sait en effet qu’il joue un rôle particulièrement important dans la lutte anti-parasitaire chez différentes espèces de poissons, la truite, la carpe, et le saumon notamment (Buchmann 1998; Harris et al. 1998; Rubio-Godoy et al. 2004).

Le « complément » est une série de réactions (Kuby 2002), de clivages protéolytiques et autoprotéolytiques pour être exact. L’objectif de cette cascade est de former le Complexe d’Attaque Membranaire, ou MAC des anglophones. Ce complexe s’encastre dans la membrane des cellules de l’agresseur, et provoque la lyse, c’est-à-dire la dissolution de cette cellule.

Le complément joue d’autres rôles, notamment l’opsonisation, qui consiste à recouvrir la membrane d’une cellule à éliminer, en permettant sa reconnaissance par les phagocytes.

Pour mesurer l’activité du complément dans nos 15 premiers poissons, nous avions un protocole qui semblait incroyablement pertinent. Nos poissons avaient été prélevés dans leur milieu naturel (une rivière de Moravie, d’où proviennent une grande partie des poissons utilisés par le laboratoire), et étaient tous infectés par au moins deux genres de parasites différents (majoritairement sur les branchies et les nageoires, donc par des exoparasites).

Au moment de leur capture, nous avons prélevé du sang sur ces poissons, dont le sérum a été extrait (le plasma contient des éléments qui inhibent l’activité du complément, des fibroïnes si je me souviens bien des explications de notre « agent infiltré » au Department of Animal Physiology and Immunology). La méthode que nous ne désespérons pas de pouvoir utiliser pour déterminer l’activité du complément est assez intéressante, puisque relativement intuitive.

Protocole

Puisque le complément aboutit à la formation de pores dans les membranes, et donc à la mort des cellules, il était assez évident de mesurer la destruction de bactéries par le sérum de nos poissons. Nous avons appliqué une mesure de diminution de la bioluminescence, deja mise en œuvre pour des mesures identiques chez la carpe Cyprinus carpio (Nikoskelainen et al. 2004).

La bactérie utilisée est une Escherichia coli, de la lignée K12, portant le plasmide pEGFPLucTet. Ce plasmide (un « chromosome bactérien » artificiel circulaire) comporte deux gènes, Luc (la Luciférase) et Tet (le gène de résistance à la tétracycline). Le second permet de sélectionner les bactéries ayant intégré le plasmide : les bactéries qui ne l’ont pas intégré sont sensibles à (tuées par) la tétracycline, ce qui nous assure de n’avoir que des bactéries transfectées dans notre bouilon.

Le gène Luc, en revanche, nous intéresse beaucoup. Il code la Luciférase, une protéine qui permet à la bactérie de devenir bioluminescente, c’est-à-dire d’émettre de la lumière. Le principe du protocole est simple. Si l’activité du complément est forte, les bactéries vont mourir rapidement, puisque leurs membranes seront altérées, et la bioluminescence va diminuer. Et inversement.

Pour être précis, nous allions mesurer l’équivalent de la dose létale à 50% (qu’on abrège en LD50 si on est anglophone, d’après mes souvenirs), c’est-à-dire le temps auquel la moitié de la bioluminescence à disparu (c’est un choix lié au fait que les courbes de décroissance de la bioluminescence mettent parfois très longtemps à atteindre le niveau 0).

Dans notre protocole, un sérum riche en complément serait compétent pour tuer les bactéries, donc aurait un temps létal à 50% plus faible qu’un sérum moins riche. Une incubation de notre plaque dans un luminomètre pendant une petit heure, et nous étions fixés.

La réalité…

Malheureusement pour nous, la réalité est beaucoup plus cruelle, et le protocole a fourni des résultats très éloignés de notre attente. Très éloignés aussi du modèle fourni lors de la présentation de la méthode (Nikoskelainen et al. 2004).

À cet « échec » temporaire, on peut trouver plusieurs raisons. D’une part, le protocole prévoit des incubations d’un certain temps, qui est très probablement dépendant de l’espèce. Les 150 minutes indiquées pour C carpio ne sont sans doute pas valables pour L cephalus, du moins pas avec nos concentrations de sérum. L’autre point, en effet, est la concentration en sérum par rapport au nombre de bactéries.

L’autre source potentielle de problèmes tient à la nature des protéines impliquées dans la cascade du complément. D’une part, elles sont autoréactives, et ont tendance à se détruire les unes les autres. Le principe du complément est de former des pores dans les membranes de cellules, il est donc normal qu’un mécanisme de contrôle existe. D’autre part, ces protéines sont très fragiles, et les aléas du travail de terrain, du transport jusqu’au laboratoire, puis les conditions de conservation, ont pu les dégrader sur nos premiers échantillons.

Pour le moment, nous avons capturé 21 nouveaux poissons, sur lesquels nous allons retenter l’expérience. A priori, le temps entre la collecte et l’analyse a été réduit à son minimum. Il n’est pas exclu que nous fassions quelques tentatives à différents temps d’incubation, dilution, etc etc.

Une partie du problème est aussi dans la quantité de sang disponible. En plus de l’activité du complément, nous étudions plusieurs autres facteurs. L’objectif étant de garder le poisson vivant, et en bonne santé, le volume de sang prélevé est limité (environ 0,5mL), et une quantité juste suffisante est disponible pour chaque poisson (pas question de s’amuser à faire varier un maximum de facteurs pour le moment, donc).

Il serait intéressant que ce protocole fournisse des résultats exploitables. D’une part parce que c’est toujours plus agréable ; d’autre part, parce que comme le faisait remarquer Jones (2001), « à l’exception de quelques modèles bien décrits, les programmes de recherche se concentrant sur l’immunité contre les parasites chez les poissons manquent ». Un premier pas à faire pour combler ce manque serait bien évidemment de disposer des protocoles adéquats…

Références

Buchmann. (1998) Binding and lethal effect of complement from oncorhynchus mykiss on gyrodactylus derjavini (platyhelminthes : Monogenea). Dis Aquat Organ, 32 (3), 195-200.

—. (1999) Immune mechanisms in fish skin against monogeneans–a model. Folia Parasitol (Praha), 46 (1), 1-9.

Buchmann et Lindenstrøm. (2002) Interactions between monogenean parasites and their fish hosts. Int J Parasitol, 32 (3), 309-319.

Harris, Soleng et Bakke. (1998) Killing of gyrodactylus salaris (platyhelminthes, monogenea) mediated by host complement. PARASITOLOGY, 117 (2), 137-143.

Jones. (2001) The occurrence and mechanisms of innate immunity against parasites in fish. Dev Comp Immunol, 25 (8-9), 841-852.

Kuby. (2002) The complement system. In Immunology 5th.

Moller et Erritzoe. (2002) Coevolution of host immune defence and parasite-induced mortality: Relative spleen size and mortality in altricial birds. Oikos, 99 (1), 95-100.

Nikoskelainen, Nuutila et Lilius. (2004) Workshop program and instructions of luminescence and flow-cytometry applications for fish immunology. University of Turku, Finland.

Rubio-Godoy, Porter et Tinsley. (2004) Evidence of complement-mediated killing of discocotyle sagittata (platyhelminthes, monogenea) oncomiracidia. FIsh Shellfish Immunol, 17 (2), 95-103.

Sheldon et Verhulst. (1996) Ecological immunology: Costly parasite defences and trade-offs in evolutionary ecology. Trends Ecol Evol, 11 (8), 317-321.

Watts, Munday et Burke. (2001) Immune responses of teleost fish. Aust Vet J, 79 (8), 570-574.

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5 commentaires

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  1. Merci pour ces explications, bon courage pour mettre au point le protocole ! Pour faire un parallèle entre mon expérience et la tienne, je constate que c’est toujours intéressant (et réconfortant ?) de trouver un article qui dit que “les programmes de recherche se concentrant sur X ou Y manquent” quand X ou Y est précisément ton sujet… A citer dès l’introduction du mémoire ! ;-)

  2. ou, encore mieux, quand une recherche sur web of science avec les mot-cles de ta recherche ne retourne pas de resultat

  3. Matthieu > Quoique-là, ça peut aussi être mauvais signe !! ;-)

  4. […] — 23 October 2007 Le hasard fait parfois bien les choses. Vous vous souvenez de ce protocole de mesure de l’activation du complément qui aurait donné des résultats tellement riches en enseignements, mais qui ne fonctionnait […]

  5. Timothee,

    poker88

    Je n’en reviens pas. J’etais a ce workshop en finlande et la methode miracle ne semble pas marcher comme prevu pour moi non plus.
    Apres l’avoir utilise sans en questionner la validite avec seulement quelques optimisations, sur le bar et la daurade, j’ai effectue une etude kinetic pour voir si la luminescence des bacteries etaient constante apres 3h d’incubation du serum avec les bacteries et surprise, rien de constant et meme une luminescence qui augmente meme en labsence de serum et une activite detectee dans le FCS heat-inactive.
    Je ne sais absolument plus comment interpreter mes resultats. J’ai remplace le HI-FCS par du PBS car l’histoire de proteines qui quench la luminescence ne semblait pas etre un probleme aux faibles concentrations de serum utilisees. et la, augmentation de la luminescence inversement proportionnelle a la concentration de serum ce qui semble etre logique mais pas de diminution notable en presence d’EGTA ou d’EDTA et meme avec le serum de poisson heat-inactive.
    Je continue a m’arracher les cheveux pour interpreter les nombreux resultats des kinetics.
    Peut-etre as-tu du nouveau depuis avril dernier?
    Merci de m’envoyer ton adresse e-mail si possible pour que l’on regarde a ca de plus pres ensemble si tu veux.
    M.

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